Det meddelade den 82-åriga partiveteranen i ett känslosamt tal i kammaren på torsdagen – dagen efter att det stod klart att Republikanerna vinner majoriteten i representanthuset.
Pelosi kommer dock att sitta kvar som kongressledamot.
Beskedet om att hon avstår från att bli minoritetsledare för sitt parti i den nya kongressen innebär att utrymme ges för personer i en ny generation demokrater att ta över ledarrollen.
— För mig har tiden kommit att låta en ny generation leda den grupp som jag så innerligt har respekterat. Jag kommer inte att söka omval till ledarskapet i den kommande kongressen.
I slutet av oktober attackerades hennes make, den 82-årige Paul Pelosi, av en man som tog sig in i parets hem i San Francisco. Paul Pelosi misshandlades svårt med en hammare och behövde under en period sjukhusvård.
Nancy Pelosi tackade i sitt tal alla ledamöter i kammaren för det stöd paret fått efter attacken och möttes av varma applåder.
Efter beskedet hyllade USA:s president Joe Biden Nancy Pelosi som "en urstark försvarare av demokratin".
Nancy Pelosi valdes in i representanthuset 1987.
