Den 45-åriga amerikanska stjärnan besegrade 23-åriga Peyton Stearns med setsiffrorna 6–3, 6–4 i USA:s huvudstad Washington.
Vinsten var Williams första i singel på nästan två år. Den enda kvinnan som varit äldre och vunnit en singelmatch på högsta proffsnivå är Martina Navratilova, som då var 47 år.
Senast Venus Williams vann i singel var i augusti 2023 i Cincinnati.
Williams, som har sju Grand Slam-titlar i bagaget på singelsidan, har lidit av myom – godartade tumörer i livmodern – som hon opererades för förra året.
— Det är inte lätt, att komma tillbaka efter all den här tiden och spela den perfekta matchen, säger Williams efter segermatchen.
I nästa omgång ställs hon mot Magdalena Frech från Polen.
Tillsammans med Hailey Baptiste vann Venus Williams även sin comeback i dubbel häromdagen, då Eugenie Bouchard från Kanada och den amerikanska tonåringen Clervie Ngounoue besegrades med 6-3, 6-1.
